Studie og evaluering av karsinogenese

Karsinogenese studeres med forskjellige standardiserte toksikologiske tester. En første del av disse testene utføres in vitro, og - hvis de er positive - fortsetter vi med et in vivo -eksperiment. Denne eksperimentelle trinnvise tilnærmingen kalles DECISION POINT APPROACH, en rekke forsøk som stopper ved slutten av hver prøve for å bestemme hvordan forsøket skal fortsette. Det er fem stadier:

FASE A: struktur og egenskaper ved den kreftfremkallende forbindelsen;

FASEB: i denne fasen av kortsiktig in vitro-testing brukes pattedyrceller. De mest brukte cellene er hepatocytter, fordi omfanget av reparasjonen av skaden som hepatocytten utvikler i henhold til alvorlighetsgraden av skaden forårsaket av stoffet, er studert. I et nøtteskall bestemmer vi ikke skaden i seg selv, men hvor mye av reparasjonssystemet som er aktivert av levercellen.

Prosedyren som er implementert er å danne 3 hepatocyttkulturer.I den første kulturen er hepatocyttene friske, i den andre blir de behandlet med teststoffet og til slutt i den tredje blir de behandlet med et kontrollstoff som absolutt er kreftfremkallende. Disse tre kulturene inneholder en radioaktiv pyrimidinbase, som er tritiert tymidin, som fungerer som en markør.

Hvis forbindelsen som undersøkes forårsaker en mutasjon i DNA, reagerer cellen på dette problemet ved å aktivere reparasjonssystemene. DNA -biten som har gjennomgått mutasjonen kuttes, og takket være virkningen av DNApolymerasen blir den manglende delen erstattet med en ny. For korreksjonen bruker DNApolymerasen de nye basene, inkludert tritiert tymidin. En radioaktiv base er inkorporert. Analysen av radioaktivitet bestemmer mutasjonsnivået i de behandlede cellene: jo høyere radioaktivitet, desto større DNA -mutasjoner.

Også i fase B tester det også på bakterier for å kunne studere om det er omvendte mutasjoner. Bakteriene som brukes er salmonellaer som allerede bærer mutasjoner. Mutasjonen gjelder syntesen av histidin, så salmonella kan ikke vokse uten histidin. Disse bakteriekoloniene blir delvis tatt for å bli behandlet med teststoffet, dels for den negative kontrollen og dels for den positive kontrollen, deretter testet med et kjent kreftfremkallende stoff. Hvis dette teststoffet er indirekte gentoksisk, må metaboliserende enzymer innføres i kulturmediet. På dette tidspunktet er det 3 kulturer som vil bli sådd og dyrket i petriskåler (det er ingen histidin i dyrkningsmediet) .Hvis det ikke har vært noen mutasjoner av kreftfremkallende stoff som skal testes, burde det i teorien ikke være noen på platene . Hvis det var en mutagen virkning av kreftfremkallende stoff, kan det ha endret den første mutasjonen og skapt en andre mutasjon som er i stand til å vokse bakteriene på det histidinfrie kulturmediet. I dette tilfellet den andre mutasjonen at den modifiserer den første mutasjonen og tar navnet RETROMUTATION Til slutt, hvis det oppstår en betydelig vekst i piasta petri, er kreftfremkallende direkte.
Alltid med en in vitro -test er det mulig å bestemme den kromosomale integriteten. Denne testen utføres alltid på pattedyrceller og brukes til å teste giftige stoffer som kan forårsake mutasjoner på noen enzymer som er ansvarlige for biosyntesen av DNA. Stoffet som skal testes blir underkastet in vitro -analyse For å kunne avgjøre om stoffet som undersøkes påvirker integriteten og antallet tilstedeværende kromosomer, brukes mikronukleustesten. Mikronuklene er vesikler som dannes med en del av kromatinet inne i. Kromatinet som er inkorporert i disse mikrokjernene kan enten være hele kromosomer eller fragmenter av kromosomer. Mikronuklene dannes ved feil celledeling som gir opphav til datterceller med genetisk materiale ikke like Resultatet av denne testen vil være bestemmelse av stoffer som er definert som clastogenic og spindelgif. mikrokjernene som inne i den er tilstede hele kromosomer.
Hvis stoffet som undersøkes induserer gentoksisitet i en eller flere tester, er dette definert som svært mistenkelig, så det går direkte til fase D. Hvis stoffet som testes på den annen side ikke gir noen gentoksisk effekt, går det over til studiefase C fordi det kan være en promoter.

FASEC: i denne fasen kan både in vitro og in vivo tester utføres.

For in vitro-tester kan det påvises at promotorsubstansen kan bryte gap-junctions mellom normale celler og tumorceller, med påfølgende passering av stoffer mellom de to cellene.

En in vivo -test er induksjon av hudtumorer hos mus. Stoffet som skal testes påføres to eller tre ganger i uken på musens hud. Innen 2/3 måneder hvis dette stoffet er en promotor kan det være papillomformasjoner. Hos mus vurderes to hoveddata: antall mus påvirket av papillomer og antall papillomer som er tilstede på hvert dyr. Hvis stoffet fungerer som en promoter og utvikler en svulst i den behandlede musen, betyr det at det faktisk er et stoff med en promotereffekt.

Når disse testene er fullført, går vi videre til langsiktige in vivo-tester.

FASERT: i denne fasen testes alle forbindelsene som viser seg mutagene og alle forbindelsene som ikke viser seg å være mutagene. Testene som kan utføres er forskjellige, noen av dem er tester utført på leveren, på lungen og til slutt på brystet.

Levertesten demonstrerer dannelsen av ikke en nydannet svulst, men et neoplastisk fokus, derfor noe som forbereder seg på å bli en svulst. Cellene i dette fokuset er allerede atypiske celler, derfor har de gjennomgått en mutasjon og forbereder seg på å bli neoplastiske celler. Etter en viss tid, takket være obduksjonsundersøkelsen, bestemmes dannelsen av pre-neoplastiske fokus, ved å beregne antall og omfang av disse pre-neoplastiske formasjonene.

Lungetesten tillater bestemmelse av et adenom, som er en "anomali av cellene i lungevevet. Også i dette tilfellet blir lungevevet til rotten undersøkt etter ganske lang tid (måneder) (disse adenomene kan lett identifiseres fordi er hvitlige knuter på lungeepitelet).
Brysttesten gjør det mulig å bestemme svulster i kjertelvevet. Antall adenomer som dannes og antall dyr som presenterer adenomer evalueres alltid.

Hvis det er positive resultater fra disse testene, er teststoffet virkelig et kreftfremkallende stoff. På dette tidspunktet går vi videre til å gjennomføre dyre tester med svært lange utførelsestider.

FASE: I denne fasen blir et variabelt antall dyr, fra 20 til 50, utsatt for langsiktige tester. Disse testene er svært dyre og tar lang tid å oppnå visse resultater; Vi snakker om omtrent 1/8 av dyrets liv. Det er mulig at noen dyr dør under prosessen med disse testene, men de blir alltid studert med obduksjon og histologisk typeundersøkelse. Dyrene som er valgt er alltid rotter og mus, og bare 70-80% overlever til slutten av de langsiktige testene. Dyrene som brukes er bare avvennet, ettersom jo yngre de er, jo mer følsomme er de for behandlinger. I løpet av den langsiktige testperioden støttes forskeren alltid av en matematiker-statistiker, som er i stand til å ta hensyn til all informasjonen som er samlet inn og reprodusere de forskjellige dataene.

Dosene som er testet på dyr starter fra den maksimalt tolererte dosen og alle dens submultipler, og dose-responsreaksjonen hos dyret blir evaluert.
Administrasjon må alltid nærme seg den måten mannen kan komme i kontakt med stoffet som undersøkes, derfor oral, kutan eller respiratorisk vei, mens hvis kreftfremkallende egenskaper til et legemiddel testes, er det også nyttig å utføre intravenøs administrering.
Dyrgruppene som er testet er 4 (50 dyr for hver gruppe):

En NAIF -gruppe som ikke har noen behandling;
En gruppe behandlet med kjøretøyet;
En gruppe behandlet med teststoffet;
En gruppe behandlet med et kjent kreftfremkallende stoff.

Det er veldig viktig at antall dyr i hver gruppe er så likt som mulig.Faktisk, hvis det er for stor forskjell i antall dyr, kan den statistiske testen vise seg å være falsk.
Evalueringene som utføres er:

Total frekvens av svulster;
Frekvens av noen svulster;
Hyppighet av dyr med mer enn én type svulst;
Antall dyrekreft.

På slutten av alle disse studiefasene er stoffet klassifisert i en rangering etablert av IARC (International Agency for Research and Development on Cancer) og av Environmental Protection Agency (EPA).